代谢组专题___常见动物类样本准备_保存及运送方式
原创 小博 中康博生物 2025-05-19 11:07 北京
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代谢物提取质量与物种及组织部位、样本制备、样本交接、提取方法与操作、以及环境等因素息息相关，故无法完全保证提取质量，望老师知悉理解，并做好组织备份。为保障获得相对较高质量的代谢物，请老师务必按照以下指导原则准备样本。
Part.01
动物组织/临床样本
1. 首先准备好用于包装样本的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表 多处写明样本编号。
2. 准确切除所需组织后，在生理盐水或 PBS 中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物。并将组织切割成小块，用镊子夹住样本，立即投入液氮冷冻。
3. 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮或转入-80℃冰箱保存样本。
4. 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。
5. LC 非靶代谢组织的量为 200mg/sample ，保留备份，干冰低温寄送，避免反复冻融。
Part.02
细胞
2.1 需淬灭剂细胞样本收集方法
淬灭试剂准备
1. 称取 85gAMBIC（碳酸氢铵）加入到 1000ml 超纯水中，得到 85g/L 的 AMBIC 溶液。
2. 然后量取 600mL 甲醇、100mlAMBIC(85g/L)及 290ml 超纯水混合，用 12M 盐酸调节 pH 至 7.4 ，最后用超纯水定容至 1L 即可。
注意：由于 pH 的变化，淬灭试剂最好现配现用。
悬浮细胞
1. 对细胞进行计数，计算 1*107 个细胞所需要的体积（即 1 体积）。
2. 取 5 体积的淬灭试剂于试管中（试管的体积应为大于等于 7 体积），置于-20℃预冷。
3. 快速从细胞培养液中取出 1 体积的细胞，放入含有淬灭试剂的试管中。
4. 轻微震荡试管 10s ，在 1000g 、4℃下离心 1min，若细胞较小或细胞未沉淀，可适当加大 转速或延长离心时间，但不宜一次提升太多，以防止细胞破损。
5. 除去上清。
6. 将细胞放入液氮，30s 后取出置于-80℃保存。
贴壁细胞
（1）酶消化法
1. 除去细胞培养基，迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞，清洗两次。
2. 除去 PBS 溶液（一定要将 PBS 去除干净，越快越好）。
3. 消化：加入胰酶，消化至部分细胞呈球状。然后加入培养基，轻轻晃动，使培养基浸润 细胞终止消化，吸出剩余培养基。加入 PBS 吹打，悬浮细胞。（ 目的是把贴壁细胞消化下 来，方便后继处理，加入的溶液量及孵育时间可以根据自己实验室具体情况进行修改）。
4. 快速计数，取 1*107 个细胞所需要的体积（即 1 体积）。
5. 快速放入预冷的5 体积的淬灭试剂中，轻微震荡离心管 10s。
6. 转子-20℃预冷,在 4℃、1000g 条件下离心 1min，若细胞较小或未沉淀，可适当加大转速 或延长离心时间，但不宜一次提升太多，以防止细胞破损。
7. 除去上清，将细胞放入液氮中，30s 后取出保存在-80℃中。
（2）刮细胞法（针对很难用酶消化下来的贴壁细胞）
1. 除去细胞培养基，迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞，清洗两次。
2. 除去 PBS 溶液（越快越好）。（不能计数的话，建议测代谢物之前做蛋白定量）。
3. 加入 5 体积淬灭试剂淬灭后用细胞刮分离细胞，将刮下的细胞转入离心管中。
4. 在 4℃、1000g 条件下离心 1min 去除上清。
5. -80℃保存，干冰运输。
注意事项：
1. 取对数生长期，培养至同一时期的细胞，建议多准备样本，以备后续使用。
2. 液氮处理细胞时，注意防止离心管破碎导致样本受损。
3. 为防止样本收集过程中细胞膜破裂，建议在全程操作不宜过度剧烈，切勿涡旋震荡、高 速离心或超声等，同时避免反复冻融，以保证细胞膜不会破损，减少代谢组学分析影响。
4. PBS 清洗时，切勿冲走细胞，清洗充分后，尽量将 PBS 完全倒掉。
2.2 无需淬灭剂细胞样本收集方法（备选方法，不便配置淬灭试剂时可采用）
悬浮细胞
1. 直接从培养基中取出细胞悬浊液，装入 15ml 离心管。
2. 1200rpm、4℃下离心 5min。离心后去除上清，沉淀为细胞，记数，每个样本细胞个数至 少 1*107 个。
3. 然后向细胞中加入预冷的 PBS ，混匀后转入 1.5ml 的离心管中。900rpm、4℃离心 3min， 将上清去除。重复清洗细胞 3 次。
4. 然后放到液氮中浸泡≥3min 淬灭。放入-80℃冰箱保存。送样时干冰寄送。 备注：最终的细胞是在 1.5mL 的离心管中，且没有液体。
贴壁细胞
（1）刮细胞法
1. 除去细胞培养基，迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞，需多次清洗。
2. 除去 PBS 溶液（越快越好），进行细胞计数（不能计数的话，建议测代谢物之前做蛋白 定量）。
3. 用细胞刮将细胞刮入离心管中。
4. 将 EP 管迅速放入液氮中≥3min。
5. 在-80℃冰箱保存。干冰寄送。
（2）酶消化法
1. 除去细胞培养基，迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞，清洗两次。
2. 除去 PBS 溶液（一定要将 PBS 去除干净，越快越好）。
3. 消化：加入胰酶，消化至部分细胞呈球状。然后加入培养基，轻轻晃动，使培养基浸润 细胞终止消化，吸出剩余培养基。加入 PBS 吹打，悬浮细胞。（ 目的是把贴壁细胞消化下 来，方便后继处理，加入的溶液量及孵育时间可以根据自己实验室具体情况进行修改）。
4. 快速计数，取 1*107 个细胞所需要的体积（即 1 体积）。
5. 转子-20℃预冷,在 4℃、1000g 条件下离心 1min，若细胞较小或未沉淀，可适当加大转速 或延长离心时间，但不宜一次提升太多，以防止细胞破损。
6. 去除上清，迅速放入液氮速冻 30s ，-80℃保存。干冰寄送。
Part.03
细胞培养液
1．将培养液摇匀，快速从培养瓶中取出一定量的培养液，4℃条件下离心（1000g ，10min）。
2 ．移取上清 10mL 至新的离心管中，迅速放入液氮中淬灭 30s。
3 ．淬灭后放入-80℃中保存。
注意事项：
寄送样本使请放入足量的干冰以保持低温条件（经验值：快递途中干冰消耗率约为 5KG/天，消耗速度与气温，泡沫箱厚度(>5cm)有直接关系，请酌情添加干冰）。
Part.04
血清/血浆
注意：一定避免反复冻融。
4.1 血清
1. 血液收集在离心管中37℃（或室温）静置 1h 进行凝固分层。
2. 然后 3000rpm 室温离心 10 分钟，取上清转至干净的离心管中。
3. 再 12000rpm、4℃离心 10 分钟，取上清分装到 1.5mL 离心管中，每管 0.2ml，-80℃冻存。 足量干冰寄送。
注意事项：
1. 一定避免反复冻融。
2. 取血时如用酒精消毒，请擦干擦拭部位，待酒精完全挥发后再取样。
3. 血清参考产率：30%50%（例如：1mL 全血大约能得 0.30.5mL 血清）。
4. 采全血时如使用真空采血管，请务必使用无预加抗凝剂的凝血管（帽盖为红色）。
5. 强烈