蛋白组专题___免疫共沉淀（CoIP）实验流程
原创 小博 中康博生物 2025-05-06 09:28 北京
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是利用抗原与抗体之间的专一性作用为基础，用于研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的经典方法，常被用于鉴定特定蛋白复合物中的未知蛋白组分。与其他分子间相互作用检测方法相比，CoIP的优势在于蛋白的结合在细胞内完成，能够反映天然状态下的蛋白质相互作用，结果更加真实可靠。
中康博CoIP互作蛋白解决方案利用高效液相色谱一质谱联用（HPLC-MS/MS）技术高灵敏性检测CoIP实验获得的蛋白，并通过定性或组间蛋白定量差异分析进行数据充分挖掘，更准确检测目标互作蛋白。
Part.01
试剂耗材与设备
1.1 试剂耗材
碳酸氢铵（Sigma-Aldrich，货号：A6141-500G）TEAB(Sigma-Aldrich，T7408-100mL)、尿素（Amresco，货号：M123-1KG）、蛋白定量染液（Huaxingbio，货号：HXJ5137）、牛血清白蛋白(Thermo Scientific，货号：23209）、二硫苏糖醇DTT（Amresco，货号：M109-5G ）、碘代乙酰胺IAM（Amresco，货号：M216-30G）、胰蛋白酶（Promega,货号：V5280/100ug）、Ziptip（Millipore，货号：ZTC18M096）、乙腈（J.T.Baker，货号：34851 MSDS)、氨水（Wako Pure Chemical Industries Ltd，货号：013-23355）、甲酸（Sigma-Aldrich，货号：T79708)）、进样瓶（Thermo，货号:11190533）瓶盖（Thermo，货号:11150635）
1.2 仪器设备
RIGOL L-3000高效液相色谱系统（北京普源精电科技有限公司）、涡旋振荡器（SCILOGEX，型号：MX-S）、真空离心浓缩仪(北京吉艾母科技有限公司，型号：CV100-DNA)、电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器有限公司，型号：XMTD-7000）、离心机（Eppendorf）酶标仪（DR200B)，电泳系统（bio-rad）、高通量组织研磨器（上海贺帆仪器有限公司，型号：hf-48）、超声破碎仪(上海沪析实业有限公司，型号：JY96-IIN)
Part.02
酶解脱盐
将胶条用手术刀切成大小约1mm3的小块，置于1.5mL 离心管中，加脱色液，匀速摇晃，重复多次至脱色至透明；加乙腈脱水至胶粒变白，真空抽干，加入终浓度为10mM DTT的工作液，37℃孵育1h；随后加乙腈脱水至胶粒变白，真空抽干，入终浓度为55mM IAM的工作液，置于暗室孵育30min；再次加入乙腈脱水至胶粒变白，真空抽干，再加入去离子水清洗，该步骤重复1次；加入50mM碳酸氢铵孵育10min，之后再加入Trypsin工作液，让酶液与胶粒充分接触，待酶液被胶粒完全吸收，37℃孵育过夜；第二天，离心收集酶解上清液，置于新的离心管中，剩余胶粒加入乙腈涡旋5min，离心收集酶解上清液，置上一离心管中合并；剩余胶粒再加入0.1%FA，重新吸水后，再加入乙腈涡旋5min，收集酶解上清液，置于上一离心管中合并，真空冻干。
使用C18脱盐柱对样本进行脱盐，100%乙腈活化脱盐柱，0.1%甲酸平衡柱子，加载样本到柱子上，随后使用0.1%甲酸洗涤柱子，洗掉杂质，最后使用70%乙腈洗脱，收集流穿液，冻干。
Part.03
质谱上机
配制流动相A 液（100%水、0.1%甲酸）和B 液（80%乙腈、0.1%甲酸）。使用10µL A液溶解冻干粉末，4℃下14000 g 离心20 min，取上清1 µg 样品进样，液质检测。液相色谱洗脱条件如表1 所示。使用ORBITRAP ECLIPSE 质谱仪，选配 FAIMS Pro™ Interface，补偿电压CV 在-45和-65 之间每1S 切换一次， Nanospray Flex™（NSI）离子源，设定离子喷雾电压为2.0 kV，离子传输管温度为320°C，质谱采用数据依赖型采集模式，质谱全扫描范围为m/z 350-1500，一级质谱分辨率设为120000（m/z），AGC为4e5，C-trap 最大注入时间为 50ms ；二级质谱检测采用“Top Speed” 模式，二级质谱分辨率设为15000（200m/z），AGC为5e4，最大注入时间为22ms，肽段碎裂碰撞能量设为33%，生成质谱检测原始数据（.raw）。
色谱梯度如下：
时间（分钟）
流动相B比例（%）
00:00
6
08:00
6
13:00
12
46:00
30
53:00
40
54:00
95
64:00
95
65:00
6
Part.04
搜库参数
数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在选择数据库时，遵循如下原则，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库。
本次使用数据库：Homo sapiens sp数据库。
采用Proteome Discoverer2.4软件搜库，检索参数设置如下：
Parameters
Value
Enzyme
Trypsin
Static Modification
Carbamidomethyl(C)
Dynamic Modification
M Oxidation（15.995Da）；Acetyl (Protein N-terminal)
Precursor ion mass tolerance
± 15ppm
Fragment ion mass tolerance
±0.02Da
Max Missed Cleavages
2
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